荷蘭Liposoma是巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes氯膦酸鹽脂質體的發明人和開發者。作為金標準的體內單核巨噬細胞清除試劑，其憑借穩定的化學性質、高效的清除能力及良好的生物相容性，已成為全球單核巨噬細胞清除的不二藥物。產品被引頻頻見刊Cell，Nature和Science，助力突破發現，拓展科學邊界。

巨噬細胞是參與廣泛生理和病理過程的關鍵高度異質性先天免疫細胞。使用ClodronateLiposomes氯膦酸鹽脂質體清除巨噬細胞通常用于研究小鼠體內巨噬細胞的功能。對受體小鼠巨噬細胞先清除，然后回輸供體的巨噬細胞細胞，在疾病模型中研究回輸巨噬細胞的功能。本Protocol以LPS膿毒癥模型為例，用體外分化、慢病毒轉導的骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）對受體小鼠回輸，先使用荷蘭Liposoma的ClodronateLiposomes氯膦酸鹽脂質體清除受體小鼠巨噬細胞，然后回輸供體小鼠來源巨噬細胞進行重建。該實驗策略可靈活應用于其他實驗方案。實驗框架設計如下：

實驗步驟

一. 骨髓細胞分離

可以參考公眾號：Target Technology關于，有詳細的protocol（Protocol：小鼠骨髓巨噬細胞的分離，分型和分選）。

1.使用CO2裝置麻醉小鼠，隨后進行頸椎脫臼。

2.用鑷子和剪刀去除骨骼上的皮膚及骨骼肌組織，并在10 cm培養皿中用冷PBS洗滌骨骼。

a. 將骨骼放入含PBS的新10 cm培養皿中，在膝關節處剪斷，分離股骨和脛骨。

b. 去除殘留組織，并在新培養皿中再次用PBS洗滌。

注意：須清除骨骼上的骨骼肌，以避免組織細胞污染。

3.用含2% FBS的冷PBS灌滿3 mL注射器。

a. 剪去骨骼兩端，輕柔地將連接28號針頭的注射器插入骨髓腔，推動PBS溶液，沖洗骨髓并將其收集于空的10 cm培養皿中。

b. 用PBS/FBS溶液重新灌滿注射器，重復該步驟，直至所有骨髓組織均被沖洗至培養皿中。

注意：PBS/FBS溶液需在每次骨髓分離前新鮮配制。

當骨髓被沖洗后，骨的顏色由深紅色變為白色（見圖 1A）。

所獲得的骨髓細胞數量取決于小鼠的年齡與遺傳背景。通常以6–8周齡小鼠作為理想的骨髓供體。

4.用5 mL移液管輕柔地上下吹打 PBS/FBS/骨髓混合物數次，以充分分散骨髓組織。然后將溶液轉移至15 mL離心管中，繼續上下吹打數次。將離心管置于冰上。

5.裂解紅細胞（一般不建議，建議重點公眾號的protocol）。

a. 離心機（1400 rpm）在25℃下離心5分鐘，以沉淀細胞。

b. 吸取上清液。加入5 mL紅細胞裂解液和1 mL FBS。重懸細胞，并在室溫下孵育5分鐘裂解紅細胞。

注意：紅細胞裂解緩沖液對骨髓細胞有毒性。加入FBS可降低細胞毒性并提高細胞活性。

6用冷PBS清洗細胞。

a. 1400 rpm離心5分鐘（4℃）沉淀細胞。

b. 將細胞重懸于10 mL冷PBS中，再次離心（1400 rpm）5分鐘沉淀細胞。

c. 重復清洗兩次。

7.將細胞重懸于1 mL預熱至37℃的RPMI 1640充分培養基中。隨后加入含有6 mL預熱RPMI 1640充分培養基（表2）的10 cm細胞培養皿。

8.在37℃和5% CO2下孵育5小時去除基質細胞。

注意：5小時后，基質細胞會附著在培養皿表面，而骨髓干細胞和前體細胞保持未附著或懸浮狀態（圖 1B）。

關鍵： 此步驟對于去除基質細胞是必需的，如果允許其生長，它們會附著在培養皿上并與分化的BMDMs混合無法區分。此步驟對于BMDMs的純度至關重要。

9.于5小時后，小心收集含有未附著細胞的培養基至 15 mL離心管中。注意不要擾動附著的細胞。

a. 1400 rpm離心5分鐘（4℃）沉淀細胞，并將細胞重懸于1 mL RPMI 1640充分培養基中。

b. 使用血球計數板（Cat#84107ES）計數細胞數量

圖 1. 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的制備

(A) 小鼠長骨在骨髓沖洗前后的狀態對比。(B) 幾個關鍵時間點的代表性細胞圖像。

二.慢病毒轉導

在此方案中，我們在BM細胞分化為BMDMs之前使用慢病毒介導的DNA轉移來修飾 BM 細胞 (Miller and Blystone, 2015)。在我們的實驗中，我們用攜帶SOCS1 cDNA的慢病毒（SOCS1-慢病毒）轉導BM細胞，使用GFP-慢病毒作為對照 (Du et al., 2020)。我們發現，轉導BM前體細胞比直接轉導充分分化的BMDMs更能有效地將基因遞送到BMDMs中。

1.將1 mL BM細胞（最多2x106個細胞）加入到含有6 mL RPMI 1640培養基的新10 cm細胞培養皿中。

注意：通常從小鼠身上可以獲得1-5 x 106個骨髓細胞，具體取決于小鼠的年齡和大小。

2.解凍慢病毒儲備液。向慢病毒溶液（0.1-0.2 mL）中加入Polybrene至終濃度為6 μg/mL。在25℃下孵育5分鐘。

關鍵：Polybrene對于提高慢病毒轉導效率是必需的。基本原理是Polybrene可以中和細胞表面和病毒顆粒之間的電荷排斥。

3.將慢病毒-Polybrene復合物以10的感染復數 (M.O.I.) 加入培養皿中的BM細胞。在 37℃和5% CO2下孵育細胞48小時。

三.BMDM制備和分化

使用細胞因子將轉導的BM細胞分化為 BMDMs。（公眾號：Target Technology，Protocol：小鼠骨髓衍生巨噬細胞（BMDM）的制備）

1.培養48小時后，小心吸出含有慢病毒的培養基，并替換為分化培養基。

注意：此時大多數BM細胞已附著在培養板上。

2.在37℃和5% CO2下繼續培養7天。每2天更換一次新鮮的分化培養基。

注意：7天后，培養細胞（BMDMs）的形狀顯得更長且更像橢圓形（圖 1B）。

轉導的BMDMs呈GFP陽性。可以通過在熒光顯微鏡下觀察細胞來估計轉導效率。可以通過Western blot評估遞送基因（如 SOCS1）的表達。

四. 脂質體注射

為了清除巨噬細胞，需要將含氯膦酸鹽的脂質體（Cat#： C-005）靜脈注射到小鼠體內。我們通過眼眶后靜脈竇注射這些脂質體(Yardeni et al., 2011)。

1.注射前兩小時，取出氯膦酸鹽脂質體（Cat# ：C-005）和對照脂質體（Cat#：P-005），使其平衡至室溫。

注意：氯膦酸鹽脂質體和PBS脂質體（對照脂質體）儲存在4℃，不可凍存。

2.顛倒脂質體管幾次（8-10次），直到液體變得均勻。

3.使用帶有28號針頭的1 mL注射器吸取0.2 mL氯膦酸鹽脂質體或對照脂質體。

關鍵：注射小鼠前務必去除任何氣泡。將空氣注入靜脈可能導致死亡。

4.在II級B2型生物安全柜中使用精密蒸發器用異氟烷麻醉小鼠。

a. 將小鼠放入腔室并緊緊蓋上蓋子。

b. 將氧氣流量計和異氟烷蒸發器設置分別調整為1 L和0.05-4%。

c. 等待小鼠進入深度昏迷狀態，然后將其從腔室中取出。可以通過足部反射消失來確認麻醉。

注意：當小鼠側臥時呼吸會變得有節奏，證明小鼠處于適當麻醉狀態。不要讓小鼠過度暴露于異氟烷，過度暴露可能導致小鼠死亡。由于麻醉的小鼠可能在15秒內醒來，注射應在6-7秒內完成。

5.注射前立即通過顛倒含有脂質體的注射器6-8次來重懸脂質體溶液，使脂質體液體均勻。

6.緩慢將0.2 mL脂質體注射到眼眶后竇中。

a. 注射時，將麻醉的小鼠側放，拉開眼睛上方和下方的皮膚，使眼睛略微突出。

b. 在眼底，將針頭在內眥處以約30°角插入眼眶后竇（見圖2）。有關眼眶后注射的更多詳細信息，請參閱參考文獻 (Yardeni et al., 2011)。

注意：如果針頭插入正確位置，應該感覺不到阻力，注射后出血很少或不出血。脂質體溶液也可以從尾靜脈注射或腹腔注射。

7.注射完成后，將小鼠放回籠中。

注意：需觀察小鼠，確保其從麻醉中恢復后方可離開。小鼠通常需要15-20秒恢復。

圖2.使用1 mL注射器進行小鼠眼眶后靜脈注射

五.巨噬細胞清除效果驗證

注射脂質體48小時后，可以通過使用熒光激活細胞分選 (FACS) 分析脾臟中的F4/80+常駐巨噬細胞來確認巨噬細胞的消除。需要此驗證步驟來建立實驗條件。一旦建立了最佳實驗條件，此步驟并不總是必要的。

1.注射脂質體48小時后，使用CO2處死小鼠，隨后進行頸椎脫臼。

a. 立即用70%乙醇消毒皮膚，用手術剪打開腹腔并采集脾臟。

b. 將脾臟放入裝滿含有10% FBS的冷RPMI1640的10 cm培養皿中。

2.將脾臟放在70 μm細胞篩上，使用1 mL注射器的末端將脾臟搗碎穿過細胞篩。將過濾后的細胞懸液收集到15 mL管中。

a. 離心細胞（1400 rpm，5分鐘，4℃）。將細胞重懸于5 mL紅細胞裂解緩沖液中，并在25℃下孵育5分鐘以裂解紅細胞。

b. 加入10 mL冷PBS。離心（1400 rpm，5分鐘）收集細胞。

c. 通過重復此步驟再次用冷PBS清洗細胞。將細胞保持在冰上。

3.FACS分析。

a. 將細胞在0.1 mL Live and Dead Violet Viability 溶液中于冰上孵育30分鐘。用冷 PBS 清洗細胞一次并離心（1400 rpm，5分鐘，4℃）。可用Calcein-AM/PI 活細胞/死細胞雙染試劑盒代替

b. 用抗小鼠MHCII FITC（1:200稀釋）和抗小鼠F4/80 APC（1:200稀釋）在黑暗中于冰上染色細胞30分鐘。用冷PBS清洗細胞一次。

c. 使用BD LSRFortessa儀器進行FACS分析。

d. 使用FlowJo軟件(V10)分析FACS數據（圖3）。

注意：通常在注射一次氯膦酸鹽脂質體48小時后，可以觀察到常駐巨噬細胞的成功清除（減少>90%）。圖3顯示了在48小時后注射一劑或兩劑氯膦酸鹽脂質體后脾臟巨噬細胞清除的示例 (Du et al., 2020)。

圖3. FACS驗證巨噬細胞清除

A.小鼠脾臟巨噬細胞在用對照脂質體、一次或兩次氯膦酸酯脂質體處理后48小時的代表性FACS分析圖。***p<0.001，單因素方差分析。B.FACS分析的定量數據（數據引自doi:10.1016/j.devcel.2020.10.023）。

六.巨噬細胞重建

氯膦酸鹽脂質體處理兩天后，可以用新的巨噬細胞重建巨噬細胞清除后的小鼠。在此方案中，我們使用了慢病毒轉導的BMDMs。這些BMDMs通過眼眶后靜脈竇靜脈注射遞送至小鼠體內。由于內源性巨噬細胞會在清除后1-2周內重新填充小鼠 (van Rooijen et al., 1989)，因此只有4-5天的時間窗口可以在小鼠中檢測外源性巨噬細胞。

因此，至關重要的是要規劃實驗，以便BMDM的體外分化在此窗口期內完成并準備好使用。

1.吸出BMDMs的培養基，用10 mL PBS清洗細胞。加入5 mL Trypsin-EDTA并在 37℃下孵育5分鐘以使細胞從培養板上解離。

注意：BMDMs通常在條件培養基中培養第7天即可使用。分化的BMDMs示例見圖 1B。

2.使用無菌細胞刮刀將細胞從培養板上刮下。

a. 將細胞轉移到50 mL錐形管中。用5 mL PBS (pH 7.0)沖洗培養皿2-3次，并將沖洗液轉移到含有收獲細胞的離心管中。

b. 輕輕吹打細胞溶液幾次以分散細胞團塊。

3.1400 rpm離心5分鐘（25℃）沉淀細胞。用無菌PBS (pH 7.0)清洗細胞 2-3 次。

4.用5 mL無菌PBS重懸細胞。用血細胞計數板計數細胞。

5.1400 rpm離心5分鐘（25℃）沉淀細胞。去除上清液，并將細胞重懸于無菌PBS中，濃度為107個細胞/mL。

6.如上所述，使用異氟烷麻醉受體小鼠（巨噬細胞清除后的小鼠）。

7.用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞溶液。使用28號針頭通過眼眶后靜脈竇緩慢注射0.2 mL BMDM溶液。

注意：每只小鼠注射2 x 106個BMDMs。可以注射0.2 mL PBS作為對照。BMDM溶液也可以通過尾靜脈注射。

8.注射完成后，將小鼠放回籠中。

注意：需觀察小鼠，確保其從麻醉中恢復后方可離開。

七.LPS誘導的膿毒癥與分析

重建后的小鼠是研究外源性巨噬細胞的體內平臺。BMDM注射36小時后，小鼠即可用于實驗。在此方案中，我們使用LPS誘導的膿毒癥模型來研究重建BMDMs的體內功能 (Du et al., 2020)。

1.將LPS溶解在無菌 PBS (pH 7.0) 中，濃度為10 mg/mL。

2.稱量小鼠體重。根據體重，計算要注射給小鼠的LPS溶液體積，劑量為20 μg/kg（體重）。

注意：對于LPS模型，小鼠的理想體重應>18克。

3.用1 mL注射器取適量的LPS溶液，并使用28號針頭腹膜內注射小鼠。

注意：注射時，在小鼠腹部右下象限以30°-40°角插入針頭。一旦針頭穿過皮膚和腹膜襯里，角度應與胃平行以避免刺穿器官。PBS可用作注射對照。

4.分析小鼠。

注意：LPS注射后幾小時內，小鼠會出現體溫過低，在此LPS劑量下，多達50%的C57BL/6小鼠可能在72小時內死亡。LPS注射會引起嚴重的全身炎癥和多器官損傷。可以在不同時間點處死小鼠進行分析。

八.預期結果

在本研究中，我們旨在評估SOCS1是否在YTHDF1下游發揮調節巨噬細胞激活的作用。為此，我們從野生型(WT)和YTHDF1(-/-)小鼠中衍生出BMDMs，然后分別用SOCS1-慢病毒或GFP (Ctrl)-慢病毒轉導這些WT和YTHDF1(-/-) BMDMs。我們清除了WT小鼠的巨噬細胞，然后用SOCS1-或GFP (Ctrl)-轉導的WT或YTHDF1(-/-) BMDMs重建這些小鼠。最后，我們將這些重建的小鼠置于LPS誘導的膿毒癥模型中。如圖4所示，與接受Ctrl-轉導WT BMDMs的小鼠相比，接受 Ctrl-轉導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠在 LPS 攻擊后死亡率要高得多（24 小時內 100% 死亡）（圖 4A），這是預期的。接受 Ctrl-轉導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠產生的血清炎癥細胞因子水平遠高于接受 Ctrl-轉導 WT BMDMs 的小鼠（圖 4B），這也是預期的。這些觀察結果表明慢病毒轉導和清除/重建程序均成功（因為所有受體小鼠均為 WT 小鼠，如果程序不起作用，受體小鼠的表型應相同）。當接受 SOCS1-轉導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠接受 LPS 治療時，高死亡率得到了預防（圖 4A），并且血清炎癥細胞因子水平降低到了 Ctrl 水平（圖 4B）。這些數據表明，清除/重建程序確實是研究外源性巨噬細胞體內功能的系統。

圖 4. 過表達 SOCS1 可糾正小鼠 YTHDF1?/?巨噬細胞的過度炎癥表型

(A) 經 LPS 刺激后，分別回輸野生型（WT）或 YTHDF1?/?骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）（并轉染 SOCS1 慢病毒或對照慢病毒）的巨噬細胞剔除小鼠的生存曲線；p < 0.0001（YTHDF1?/? + 對照 + LPS 組與其余各組比較）。

(B) 經 LPS 刺激后，分別回輸野生型（WT）或 YTHDF1?/?骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）（并轉染 SOCS1 慢病毒或對照慢病毒）的巨噬細胞剔除小鼠的血清細胞因子濃度。*p < 0.05，**p < 0.01；*p < 0.001，****p < 0.0001，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。所有數據均以平均值 ± 標準差（mean ± SD）** 表示。